如何提高CAR-T细胞疗效及安全性，攻克实体瘤？

CAR-T 疗法是当今最火热的免疫治疗之一，也是近年来免疫医学的重大突破。自 2017 年美国 FDA 批准第一款 CAR-T 疗法上市后，欧洲、加拿大、日本也紧随其后批准了 CAR-T 产品上市销售。然而，要实现 CAR-T 细胞更广泛的治疗应用，就必须在多个层面进行设计，进而提高疗效、安全性和攻克实体瘤。最近，来自美国加州大学（University of California）的研究人员对 CAR 设计、影响 CAR-T 细胞活性及 CAR-T 细胞与肿瘤微环境之间的相互作用三个方面进行了综述，以期帮助科研人员更好地提出 CAR-T 细胞治疗改进策略。

CAR的多种设计方法

布尔逻辑和逻辑门常被用来检测 CAR 与多种抗原组合的反应，以寻找到可提高 CAR-T 细胞的安全性和抗肿瘤效果的方法。

“和”逻辑 (And logic) 中需要联合使用两种不同的抗原来激活 CAR-T 细胞，这种特异性的增加能降低 CAR-T 细胞脱靶效应 (on-target, off-tumor) 所带来的毒性风险，这种毒性会攻击与肿瘤细胞相同抗原的健康组织。

而与 “和 - 非” 逻辑（AND-NOT logic）一起使用就可以防止对健康细胞的毒性损伤。这种策略利用了一种抑制 CAR (iCAR)，它针对健康组织上发现的抗原，并与肿瘤相关抗原（TAA）激活的 CAR 进行配对。“和”和 “和 - 非” 逻辑下的 CAR-T 细胞通过增加特异性提高了安全性。

“或”逻辑下 CAR 可以识别两种不同的肿瘤相关抗原，并且与任一抗原的结合都会诱导 T 细胞的激活，可通过避免抗原逃逸或肿瘤细胞丢失靶向表位来提高抗肿瘤疗效。

图 | 组合抗原识别：“和”、“和 - 非”、“或” (来源：Cancer Cell 2020)

图 | ON/OFF 开关和适配器介导的激活 (来源：Cancer Cell 2020)

除了上面提到的布尔逻辑和逻辑门，采取外部诱导或自调节开关的形式也可以改进 CAR 的安全性和可控性。

在 CAR-T 细胞治疗中已经观察到的系统性毒性包括：细胞因子风暴（Cytokine release syndrome, CRS）、神经毒性和脱靶效应（On-target/off-tumor recognition）、CAR-T 细胞相关脑病综合征(CRES)、肿瘤溶解综合征和过敏反应等。当 CAR 产生的毒性成为一个可预期的风险时，人们开始探寻调节 CAR-T 细胞活性的方法。

调节 CAR-T 细胞活性的方法之一，是通过调节 CAR 蛋白本身的稳定性或构象来调节CAR 的活性。比如，可以通过小分子药物或制造缺氧条件来控制 CAR。控制 CAR 蛋白的变化不仅可以调节蛋白质的半衰期，还可以调节 CAR 功能的可用性，这样受体只有在特定的条件下才具有信号能力。例如，CAR 的抗原结合区域可以被一个内置的抑制肽“掩蔽”，这样 CAR 的功能结构只有在抑制肽被通常活跃在实体瘤微环境中的蛋白酶裂解后才能被激活。

科学家 Urbanska 曾发现一种 “通用” 受体，它包含生物素结合域，能融合到 T 细胞信号域上。原则上，表达这种生物素特异性受体的 T 细胞可以靶向任何已被生物素化抗体标记的靶细胞。

以此产生的对应策略有两种：

(1)通过使用或保留生物素化抗体来控制 T 细胞的开 / 关状态;

(2)通过改变生物素化抗体的特异性，使用相同的生物素特异性受体来靶向多种实体瘤微环境。

除了设计 CAR 本身，在细胞水平上改变 T 细胞活性也会显著影响 CAR-T 的治疗效果和安全性。

调控 CAR-T 细胞活性的多种设计方法

由 mRNA 电穿孔引起的短暂 CAR 表达，可以减轻 CAR 交叉识别健康组织引起的毒性。例如，针对治疗白血病和骨髓瘤的 CD44v6 抗原靶向的 CAR-T 细胞已经被设计成单纯表达疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK），这使得 CAR-T 细胞暴露于更昔洛韦药物后，3 天内即可被有效清除。

另一种抑制毒性的方式是通过小分子、单抗药物使 CAR-T 细胞衰竭。如使用诱导型 caspase 9（iCasp9）药物，在 30 分钟内即可消除 90% 以上的 CAR-T 细胞。此外，表面蛋白 CD20 或截短表皮生长因子受体（tEGFR）的转基因表达也可以促进自杀机制。美国 FDA 已经批准的单抗药物中，利妥昔单抗和西妥昔单抗可以分别与 CD20 和 tEGFR 结合，由此消除表达这些抗原的 CAR-T 细胞。

虽然自杀基因可以控制 CAR-T 细胞的毒性，但自杀基因的激活也会导致治疗的不可逆终止。

另一种可逆策略是利用达沙替尼 (Dasatinib)，一种酪氨酸激酶抑制剂来干扰淋巴细胞特异性蛋白激酶（LCK）。达沙替尼已被证明是一种可逆的 CAR-T 细胞活性开关，停止给药可以迅速逆转其抑制作用，从而使其成为 CAR-T 治疗导致的致命毒性如 CRS 和 CRES 的潜在应急药物。还可以使用转录调控，通过在翻译后调控的方式，在保证 CAR 的稳定和功能的条件下提高 CAR-T 细胞的安全性。例如，小分子药物多西环素（Dox）可以在 CAR 表达过程中起“开关” 作用。

除了控制基因的表达来控制 CAR-T 细胞活性外，另一种方法是使用基因编辑技术将特定基因整合到受内源性转录机制调控的特定基因位点中，进而控制 CAR-T 细胞活性。

已经有证据表明，转基因插入特定位点将影响 CAR-T 细胞的功能。如使用 CRISPR/Cas9 将 CAR 转基因插入到 TRAC 位点产生的 CAR-T 细胞比使用逆转录病毒将 CAR 随机插入基因产生的 CAR-T 细胞在体内拥有更好的功能。基因编辑技术还可以消除内源性基因，用来保护 CAR-T 细胞免受移植物抗宿主病（GvHD）的伤害，以支持使用异体 T 细胞治疗。基因编辑技术也可以用来消除 T 细胞活性负调节因子的表达。肿瘤细胞经常上调免疫检查点受体的配体，如 T 细胞上的 CTLA-4 和 PD-1，导致肿瘤微环境中的 T 细胞活性受到抑制。

虽然 CAR-T 细胞对血液瘤有很好的治疗效果，但对实体瘤的靶向性却受到许多阻碍和挑战。除抗原异质性外，肿瘤细胞在肿瘤微环境中会产生致瘤和免疫抑制因子，这种抑制环境与免疫抑制细胞作用叠加进一步影响 CAR-T 细胞的疗效。

目前可通过改造 CAR 来对实体瘤进行杀伤，其原理是将 CAR 设计为对肿瘤微环境中的细胞因子起作用。在肿瘤微环境中常见的免疫抑制性可溶性因子中，转化生长因子 b（TGF-b）是一种作用效果明显的细胞因子。可以将 CAR 设计为对 TGF-b 起反应，使 CAR-T 在 TGF-b 存在的条件下增殖，保护附近细胞免受 TGF-b 的抑制作用。还可以使用“开关受体” 嵌合体来对 CAR-T 细胞进行调控。如由 IL-4 组成的“开关受体”在 CAR-T 细胞中的共表达可以增强它们的抗肿瘤能力。除了增强 CAR-T 细胞的功能，“开关受体” 还可以减轻免疫检查点的抑制作用。还有的改造策略是使 CAR-T 细胞靶向通过促进肿瘤生长和转移的可溶性因子来控制肿瘤增长。

CAR-T 细胞如何对抗肿瘤微环境

肿瘤微环境的免疫逃逸和免疫抑制特性导致了 CAR-T 细胞对实体瘤治疗效果不佳。

目前已知的肿瘤微环境特征包括：（1）免疫细胞需要穿透肿瘤的物理屏障；（2）检查点配体上调；（3）肿瘤前基质生态位；（4）丰富的免疫抑制和促转移可溶性因子；（5）调节趋化因子的表达，以优先招募具有免疫抑制表型的白细胞。

这些已知特征又推动了 CAR-T 细胞的设计。改造后的 CAR-T 细胞可以在肿瘤微环境中过度表达趋化因子受体，使肿瘤的防御机制转向针对自身；同时 CAR-T 细胞通过表达肝素酶（一种降解高密度结构细胞外基质的酶）可以改善在肿瘤浸润和整体存活率。

图 | CAR-T 细胞（黄色）正在攻击乳腺癌细胞（粉色）（来源：德国罗伊特林根 “科学之眼” 摄影工作室）

成功到达实体瘤的 CAR-T 细胞接下来将面临大量抑制性和逃避性特征，为了提高在这种免疫抑制环境中的治疗效果，需要将 T 细胞改造为可表达出以下效果蛋白质的 CAR-T 细胞：

（1）以自分泌方式改善 CAR-T 细胞功能

细胞因子是一种信号蛋白，具有显著增强或消除 CAR-T 细胞功能的能力。与免疫刺激细胞因子共同表达的 CAR 可显著提高免疫抑制性。例如，与单独表达 CAR 的 T 细胞相比，构成共表达靶向 CD19 、 IL-2、IL-7、IL-15 或 IL-21 的 CAR-T 细胞能够实现更好的体内肿瘤控制率和增加在体内的持久性。

（2）破坏免疫抑制元件

免疫检查点受体和配体如 PD-1/PD-L1 在肿瘤微环境中普遍表达，它们可以潜在地抑制 CAR-T 细胞的细胞毒性并诱导无反应性。因此，免疫检查点阻断与 CAR-T 细胞治疗具有很强的协同潜力。CAR-T 细胞已被设计为分泌免疫检查点抑制剂，包括抗 PD-1 单链抗体和抗 PD-L1 抗体。

（3）诱导肿瘤微环境重塑

实体瘤微环境中还含有多种促进肿瘤发生和抑制 CAR-T 细胞功能的可溶性因子。例如，前列腺素 E2（PGE2）是一种生物活性脂质，通常在肿瘤中上调，它通过调节细胞增殖、迁移、凋亡和血管生成促进肿瘤存活。在 CAR-T 细胞治疗的背景下，PGE2 和腺苷通过激活蛋白激酶 A（PKA）抑制 T 细胞信号传导和活化，从而降低 T 细胞增殖和效应器功能。同样通过改造后能表达过氧化氢酶基因的特异性 CAR-T 细胞，可以提高细胞内过氧化氢酶水平，减少细胞内过氧化氢含量，从而提升其对肿瘤细胞的溶解能力。

其他的提高 CAR-T 细胞治疗效果的方法还有很多，如将 CAR-T 细胞设计成分泌细胞因子或其他可溶性因子，以旁分泌或内分泌方式诱导肿瘤微环境重塑。此外，CAR-T 细胞还可以通过分泌双特异性 T 细胞接合器（BiTEs）来促进内源性 T 细胞与肿瘤细胞的结合。

结语

CAR-T 细胞治疗在治疗血液瘤方面显示出巨大的前景。然而，对实体瘤的治疗还面临诸多挑战，需要进一步改造 CAR-T 细胞来治疗这些难治性恶性肿瘤。同时，在推进 CAR-T 细胞治疗实体瘤的临床转化过程中，还需要平衡 T 细胞内不同特性之间的生物复杂性和潜在干扰。